Molecular erfðarannsóknum aðferð

Til að kanna og skilgreina afbrigði í DNA byggingar sem notuð er sameinda erfðafræðilega aðferð. Fyrir hverja DNA svæðinu sem er, sem lítur þessu svæði á litningi, geni eða erfðavísi, þær aðferðir eru mismunandi. Að baki hverja sameindarmassa sem erfðafræðilega aðferðin felur í sér sum eða annarar meðferðar á RNA og DNA. Allar þessar aðferðir einkennast af gríðarlegum flókið, án þess að aðstæður á rannsóknarstofum er ekki hægt að fara út, og starfsfólk verður að vera mjög hæfur. Þessi vinna fer fram í nokkrum áföngum.

stigum

Í fyrsta lagi, tákna RNA eða DNA sýni til að framleiða. Hér, sameindaþyngd erfðafræðilega aðferð er hægt að beita til nánast hvers konar efni: a dropa af blóði með hvítum blóðkornum, fibroblasts menningu, slímhúð (skafa), jafnvel hársekkjum, - DNA er hægt að fá úr öllum sýnum. Það er við hæfi á að nota nein sameinda erfðafræðilega aðferðir og ýmis valkosti sína og hafa lengi einangrað DNA-ið er geymd frosin. Annað stigið er tileinkuð uppsöfnun þeirrar vöru sem óskað brot (mögnun) af DNA, eins og það hjálpar tryggja keðjuverkandi fjölliðunar áhrif in vitro, (in vitro án þátttöku lifandi lífvera). Þar af leiðandi, sem valin hefur verið DNA brotið margfaldar eftir þennan keðjuverkun, og magn af DNA eykst bókstaflega milljón sinnum.

Þriðja skrefið í sameinda aðferðum erfðafræðilega rannsókn er gert ráð fyrir og er það margfaldað DNA Takmörkun (þetta sundrungu, að rífa eða klippa). Takmörkun framkvæmd með rafdrætti á polyacrylamide eða geli. Þessi sameinda-erfðafræðilega Aðferðin úr rannsaka á DNA brotið gerir alla til að taka ákveðna stöðu í hlaup. Eftir það, er hlaupið meðhöndluð með ethidium brómið, fært um að bindast DNA, geislun með útfjólubláu ljósi, þá er það mögulegt að fylgjast með luminescence hluta. Molecular erfða greiningartækni er fjölbreytt og fjölmargir, en fyrstu tvö skrefin eru sameiginleg öllum. En til þess að bera kennsl á DNA brot, hlaupið má lituð, og mörgum öðrum núverandi aðferðum.

tegundir

Mest bein og útbreidd aðferðir til að skynja að mycobacteria geta falið í sér ofan sameinda erfðafræðilega DNA námsaðferð. Kjarni hennar er að, í því skyni að bera kennsl á skanna keðja efni á tilteknum brotum af DNA sýkla. Molecular erfða greiningaraðferðir hafa ekki enn skilvirkari leið til að viðurkenna slíka sjúkdóma eins berklum. Notkun pólýmerasa keðjuverkun (PCR), getur þú verið viss um að upprunalega DNA mun auka fjölda eintaka í milljón sinnum, það er, það verður mögnun, og það mun sýna niðurstöður. Næmi stig er mjög hár - en níutíu og fimm prósent, sem er helsti kostur þessarar aðferðar.

The hvíla af the sameinda-erfðafræðilegum aðferðum við rannsóknir á árangri með ávöxtun mörgum eintökum bókstaflega tvöfaldast, þar sem í þessu tilfelli að semja sýnið sýnir ákveðinn sérstakur fákimisröðin aukinn í eina hundrað og sex sinnum. Jafnvel menningu greining á berklum í öndunarfærum lækka verulega viðkvæmar þær eru. Þetta er ástæðan fyrir nútíma læknisfræði er byggð á sameindasíum erfðafræðilegum aðferðum við greiningu á berklum. A lýst aðferð er árangursrík sérstaklega þegar að takast á við sýkla af ónæmisvaka breytileika hár, að ákveða að önnur leið er miklu erfiðara - krefst sérstakra næringarefna fjölmiðla og rækta langan tíma. Lífefnafræðilegar og sameinda erfðafræðilega aðferðir framleiða mjög mismunandi áhrif á niðurstöður.

greining á berklum

Marshall PCR greining á berklum algengast að nota þau DNA-raðir, sem eru sérstök fyrir öllum fjórum gerðir af sjúkdómsins. Til að ná þessu markmiði nota oft grunnur að uppgötva runa ER þættir (IS-986, IS-6110), sem þessir þættir einkenna víðförulla tegundir Mycobacterium tuberculosis og alltaf til staðar mörg eintök í genamengi. Einnig DNA útdráttur er hægt að framkvæma úr hreinum menningarsvæðum hennar og er klínískt (sputum sjúklinga sem) samkvæmt hverjum öðrum viðeigandi hætti. Til dæmis, það Boom aðferð þar sem rofjafna er notaður byggt á gúanidín þíósýanat og kísil sem burðarefiii DNA. Fjöldi sjúklinga sem eru mismunandi léleg gerla vaxandi á hverju ári, og því í klínísku starfi hefur komið alveg mismunandi stig af stofnun: sameinda-erfðafræðilega aðferð við að læra DNA hefur verið að spila stórt hlutverk í greiningu.

Hins vegar verðum við að viðurkenna að það er ekki án göllum. PCR aðferðin er að nota oft koma upp á mikla fjölda rangra, jákvæðra niðurstaðna, og ástæðan er ekki aðeins tæknilega villur, heldur einnig eiginleika aðferðarinnar sjálfrar. Að auki, með því að nota þessa aðferð við greiningu til að ákvarða hagkvæmni mycobacteria sem búið er að skilgreina, það er einfaldlega ómögulegt. En þetta ókostur er ekki mikilvægur. Molecular erfðafræðilega aðferðir við PCR diagnosis í för með sér hættu á mengun af völdum sveppagerla DNA. Vottun kröfur fyrir þessa ástæðu að fyrir PCR rannsóknarstofum hannað eingöngu hart, að þeir þurfa þrjú aðskilin húsnæði. PCR tækni er nútímalegt og mjög flókið, það þarf að nota viðeigandi búnað og hár þjálfað starfsfólk.

bacterioscopy

Þegar greining niðurstöður greiningarinnar verður saman við önnur gögn: klínískrar rannsóknar, myndgreiningu, smear smásjárrannsókn, ræktun og jafnvel vegna tiltekinnar meðferðar eru mjög mikilvæg. Í þessari röð, PCR rannsóknir er aðeins einn af þáttunum. Greina sjúkdómsvalda í byrjun greiningu geta verið einfaldasta og fljótlegasta aðferðir - sýkla.

There er notað er með létta bergfræðismásjá (litarefni Ziehl-Neelsen) og sjálflýsandi (litarefni fluorochromes). Kosturinn er hraði frumustrok niðurstöður. En galli hennar er með réttu talin takmarkaða getu vegna lágt næmi. Hins vegar er þessi aðferð gefið ráðleggingar og hagsýnn og jarðar til greina sjúklinga með berkla. Greining á mycobacteria gerlafræðilegra aðferð hefur flýtiritunarþjónustu gildi og það ákvarðað magnbundið gerla útskilnaði. Miklu meira sjálfstraust til að takast á við það sameinda erfðafræðilega rannsóknaraðferða berkla.

Cultures

Betri uppgötvun mycobacteria viðurkenna menningarfræði. Sáning sjúklega efni sem það er gert í egg miðli: Mordovsky Finn II, LJ, og þess háttar. Viðmið um viðnám mycobacteria til lyfja og óbeinum sönnunargögnum um árangur af fjölda mycobacteria og nýlendur þeirra in vitro, ef aðferð sem beitt rannsókna menningar. Til að auka hlutfall af að einangra mycobacteria sáningu sjúklega gagna kemur haldin á mörgum umhverfi.

Mæta þörfum fjölmargra menningar, sýkla meðal styrk og vökva. Notað í þessu kerfi og sjálfvirk mæling gerð VANTES vexti. Ræktun verður haldið í ræktun fyrir allt að sjö til átta vikur. Í þetta sinn uppskera með skort á vexti getur talist neikvæð. Áhrifaríkasta leiðin til að uppgötva Mycobacterium tuberculosis íhuga lífsýni sem: sjúkdómsgreiningar efni lagst naggrísum, sem eru mjög næm fyrir TB.

Sumir tölur

Áhugavert fræðigrein, sem var opnað með PCR greiningu var að kanna M. tuberculosis - dulda sýkingu. Nútíma hugtakið TB sýkingu bendir til þess að af hundrað manns sem voru í snertingu við M. tuberculosis, níutíu getur vel verið sýkt, en aðeins tíu af þeim eru virkir sjúkdómur er verið að þróa. Aðrir hafa TB ónæmi, og vegna níutíu prósent tilvika sýkingin er dulda. Uppgötva munstur að það hefur hjálpað nýta sameindasíu erfðafræðilega aðferð.

Erfðafræðingar segja að fimmtíu og fimm prósent af þeim sem ræktun sjúkleg efni voru neikvæð og áttatíu prósent af fólki sem eru sýktir af M. tuberculosis, en flýtur án röntgenmyndastaðfestra birtingarmyndir sjúkdómsins, PCR jákvæð viðbrögð borist. Það er erfðafræðilega greiningaraðferð aðstoðað við að greina sjúklinga sem eiga á hættu með PCR með því niðurstöður, þar sem niðurstöður greininga þeirra (smásjárrannsókn og culture) voru neikvæðir, og vægur sýking M. berkla var til staðar.

nútíma rannsóknir

The Russian Federation og sýkla rannsóknarstofum að nota að flýta aðferð I af hreinu þéttni: nítrat redúktasa virkni mycobacteria prófuð með því að Griess hvarfefni. Anti-TB miðstöðvar nota aðferð sem gerir að ákvarða lyfjaþol. Þetta sáningu í vökva, þar sem sjálfvirk geislinannæling og blómstrandi bókhald kerfi vexti mycobacteria. Slík greining er gert hratt - allt að tvær vikur.

Eins og er, nýjar aðferðir eru í þróun: lyf viðnám mycobacteria er mæld á arfgerð vettvangi. Rannsókn á sameinda Orsakir ónæmis gena og sýnir tilvist í mycobacteria. Þessi gen eru í tengslum við ónæmi fyrir ákveðnum lyfjum. Til dæmis, kasa gen, Inha, katG ónæmur fyrir ísoníazíði, rpoB geninu - rifampicín 16Sp RNA genum og rpsL - streptómýsíni, emb1 - til etambútóli, Gyra - a flúorókínólón og svo framvegis.

stökkbreytingar

The nútíma sjúkdómsgreiningu jók marktækt sameinda-erfðaefni stigi aðferð til að rannsaka DNA og leyft að framkvæma stór-mælikvarði rannsóknir á stökkbreytingum í öllum litróf þeirra. Nú vitum við að algengustu stökkbreytingar í 516, 526 og 531 táknum sem rpoB gen, og bent á gegn ýmsum lyfjum. Það er allt svið aðferða til að slá á mycobacteria nota ekki aðeins hefðbundnum aðferðum - lífefnafræðilegum, líffræðilegum og menningarlegum, en einnig mikið notað nútíma sameinda erfðafræðilega tækni. Þegar það eru fullnægjandi og veita rétta greiningu aðferð til að greina monogenic sjúkdóma. Þær byggjast á rannsóknum DNA í the nákvæmur sviði tilteknu geni. Þetta er yfirleitt flókið ferli, tímafrekt og dýrt, en gögn sem er veitt af sameinda erfðafræðilega greiningu, er miklu nákvæmari og upplýsandi en gögnum öllum öðrum greiningum.

Það hefur lengi verið vitað að DNA breytist ekki fyrir allt líf á lífveru sem það er í einhverju kiradum frumum odnakova, og þetta gerir það mögulegt að taka við greiningu á algerlega öllum frumum líkamans, á hvaða stigi ontogeny. The skemmst gen er hægt að uppgötva áður útliti fyrstu einkenni á fullur-mælikvarði klínískum sjúkdómi, sem og í heilbrigðum arfblendna fólk, en hafa stökkbreytingu í geni. Molecular erfðafræðilega erfðasjúkdómi greiningaraðferðir leyfa að koma í ljós hennar (beina aðferð, er DNA-greiningu), auk þess að greina aðskilnað sjúkdómsins í fjölskyldunni með prjónamerki loci DNA (arfgenga fjölbreytni), sem eru nátengd með skemmdri gen (þ.e., munu óbein nálgun að DNA-Diagnostics). Beint eða óbeint - hvers kyns DNA Greiningin er byggð á þær aðferðir sem geta borið kennsl á strangt skilgreind hluta af manna DNA.

beinum aðferðum

Bein aðferðir við DNA greiningartæki eru þegar sökudólgur genið erfðasjúkdómi er þekktur, eins vel þekkt, og tegundir stökkbreytinga hennar. Til dæmis felst hentug beinum aðferðum í fjölda sjúkdóma. Þessi fettubrettusýki (lenging CTG-endurtekningar), fenýlketónúreu (R408W), slímseigjukvilli (delF508, meiriháttar stökkbreytingum) og þess háttar. Helstu kostur á beinu aðferðinni er að fullu í eigu greiningu nákvæmni, og það er engin þörf á að gera DNA greiningu á restina af fjölskyldunni. Ef stökkbreyting í samsvarandi geni er að finna, það gerir einmitt samþykkja greiningu á arfgengi, arfgerð ákvörðun fyrir the hvíla af the byrðar fjölskyldunnar.

Annar kostur af beinum greiningu er talið að auðkenna heterozygous smitberi slæmur stökkbreytinga frá ættingjum og foreldra sem létust af völdum sjúkdómsins. Þetta er sérstaklega við um sjúkdóma litnings víkjandi. Göllum beinum aðferðum eru einnig í boði. Að beita þeim, þú þarft að vita nákvæmlega staðsetja meingensins, exon-intron uppbyggingu litróf hennar og stökkbreytingar hennar. Ekki eru allir monogenic sjúkdómar dag hafa fengið slíkar upplýsingar. Informativeness beinum aðferðum getur ekki talist heill, því einn og sama genið kann að hafa mikinn fjölda af sjúklega stökkbreytingu sem veldur þróun arfgenga sjúkdóma.

óbeinum aðferðum

Óbeinum aðferðum í DNA greiningu eru notaðir á öllum, en í öðrum tilvikum, ef skemmd gen er ekki greind, en aðeins litningatjáðum, eða ef línan greiningin ekki gefa niðurstöðu (það gerist, ef genið flókin sameinda stofnun eða miklu leyti, ef það er mikið sjúklegar stökkbreytingum). Óbeinar aðferðir gerðar aðgreiningu greiningar á fjölbrigða merkjum í samsætu- fjölskyldu. Markers finna í sama litninga svæði eða genasæti sé nátengd sjúkdómsins og tákna úrfellingum eða innsetningum, beinir substitutions, endurtekur, og polymorphism þeirra er vegna þess að mismunandi magn af frumum í blokk.

Mest þægilegt fyrir óbeinum greiningar talið microsatellite og minisatellite polymorphisms, sem eru víða dreift í genamengi mannsins. verðmæti þeirra lýst í mikilli upplýsinga efni, ef skemmdir á erfðaefni fjarlægð milli prjónamerki og gensins er ekki of stór. Í síðara tilvikinu, til þess í matinu nákvæmni er ráðist að miklu leyti á tíðni endurröðunar milli fjölbrigðaforminu merkið og skemmdum. Óbein greiningartækni getur séð einnig að fylla út undirbúningsþrep að samsætan tíðni rannsóknarinnar greindu íbúa á meðal sjúklinga og burðarefni í stökkbreytinga, auk nauðsyn þess að ákvarða líkur á endurröðun á nonequilibrium og nota viðloðun merkjum og stökkbreytt samsætur.

aðrar aðferðir

Stutt hluti af RNA eða DNA, sem og einum gen skoðaðir í smásjá rannsókn getur ekki verið, því, til að bera kennsl stökkbreytingar sem þarf í sameinda erfðafræðilegum greiningu. Það er "Human Genome Project", auk annarra framfarir í sameindaerfðafræði aukið mikið möguleika á við greiningu á arfgenga sjúkdóma - bæði fyrir og eftir fæðingu. Þessar aðferðir geta veitt snemma uppgötvun og Spáið polý- og monogenic sjúkdóma, sem frumraun á sér stað á fullorðinsárum. Því miður, vegna þess að tæknilega getu sameinda erfða rannsóknir eru stundum utan siðferðilegum takmörkunum sem eru settar með tilliti til eignar, sérstaklega þegar greiningin er á unglingsárunum og æsku.

Burðarvirki og tölulegar litningabrengl eru algengustu orsakir sjúkdómsins og krabbamein, og margir vansköpun. Litningafrávik þarf að vera skilgreind, sem er mikilvægt fyrir fjölskylduráðgjöf - að meta spá, ásamt áhættu í framtíðinni meðgöngu æxlun. Litningi greining er "gull staðall" erfðafræðilega greiningu, en það er takmarkað. Aðeins aðferðir sameinda erfðafræðilega greiningu geta gert meira, vegna þess að það er notað einrækt tækni byggir blómstrandi merki sem geta háu næmi þeirra til að bera kennsl lúmskur litningagalla breytingar sem eru ómögulegt að greina klassíska frumumyndun rannsóknir. Þessar aðferðir eru sífellt vaxandi greiningar- getu okkar, þegar skoðuð, börn með þroskahömlun, þroskahömlun, með mörgum öðrum arfgenga sjúkdóma.

niðurstöður

Það er mjög mikilvægt fyrir mannkynið voru gen Uppbyggingu og starfsemi þekkingar, tegundir af breytileika, gerir mögulegt að finna erfðasjúkdómum sem áttu sér stað í tengslum við þróun á sameindaerfðafræði. aðferðir hennar miða að því að rannsókn á DNA-sameindarinnar - og þegar það er eðlilegt, og þegar það er skemmst. Undirbúningur deoxýríbókjarnsýrur röð sýru af kirnum (DNA) sem teygir sig í áföngum frá því að fá sýni til að auðkenna einstaka brot. Einangrun DNA úr genamenginu úr sellum, takmörkun (ofsafenginn), mögnun (klónunarfyrirkomulagi), Electrophoresis of brotunum (aðskilja rafhleðslu þeirra og sameindaþunga með því að geli). Að bera kennsl á tilteknum brotum staðsett á yfirborði stakur rönd.

Þá fá inn í lögin sérstökum síum, í gegnum sem fer í hvers brots kynblöndun með klóna DNA brotin eða tilbúið geislavirkum þreifurum er stjórna, sem mun vera jöfn hverjum prófsýnið í þessari röð. Ef þú breytir stöðu eða lengd miðað við rannsaka, ef nýr bútur eða horfið - allt þetta bendir til þess að greina gen hefur verið endurskipulagður í kirnisröðinni. Það eru átta helstu aðferðir of Molecular erfðafræðilegum rannsóknum: raðgreiningu (ákvörðun á DNA runu), keðjuverkandi fjölliðun DNA (aukning á fjölda fyrir kirnaröð) að sameina framleiðsluna á vísum þekkt gen, DNA einrækt, Framleiðsla á raðbrigða sem leiddar eru prótein vegna samskeyttra sameindir, að búa til heill setja (safn Library) einræktaður brot sem voru fengnar með því að nota takmörkun.